Analyse der Expressionsmuster der Proteasegene des parasitischen Protozoons Entamoeba histolytica und Einfluß von Crithidia fasciculata auf das Wachstum von Entamoeba histolytica

Entamoeba histolytica ist der Erreger der Amöbiasis. Die Amöbiasis ist eine invasive Erkrankung, die in intestinale und extraintestinale Form unterteilt wird. Bei der intestinalen Amoebiasis kommt es zu Schleimhautschädigungen im Darm und dies verursacht häufig Kolitis und Diarrhoen. Diese Art der Amöbiasis wird auch Amöbenruhr genannt.
E. histolytica ist ein hochpathogener Parasit. Es werden derzeit als Pathogenitätsfaktoren die Adhärenz der Amöben an Wirtszellen, die vorallem durch ein Galaktose und N-Acetyl-Galaktosamin inhibierbares Lektin vermittelt wird, das Abtöten von Wirtszellen durch ein porenbildendes Peptid (Amoebapore) oder die Proteolyse von extrazellulären Matrixproteinen des Wirts durch Cysteinproteinasen vermutet.
Im Rahmen der Diplomarbeit sollten bislang bekannte Proteasegene (Cysteinproteinasen und eine Dipeptidylpeptidase) und neue Proteasegene von Entamoeba histolytica mit Hilfe von radioaktiven Northern Blots auf ihre Expression hin untersucht werden. Es konnten zehn putative Proteasegene in der Entamoeba-Datenbank identifiziert und acht davon mittels PCR teilweise amplifiziert werden. Da das Genom von Entamoeba histolytica zum Zeitpunkt der Diplomarbeit noch nicht vollständig sequenziert war, bleibt abzuwarten, ob noch weitere Proteasen gefunden werden können.
Es stellte sich heraus, daß Variation der Kulturbedingungen nicht zu einer Induktion der Expression der Cysteinproteinasen führte. Ob man durch weitere Kulturbedingungsveränderungen eine Expression induzieren kann, bleibt abzuwarten. Die Ergebnisse im Western-Blot, im Substratgel und im Aktivitätstest müssen auf Kreuzreaktionen der zugegebenen Organismen untersucht werden. Es kann so nicht ausgeschlossen werden, daß Proteasen von C. fasciculata, E. coli oder B. subtilis eine Reaktion verursachen
Überraschenderweise ist die Proteinmenge und die Aktivität der Cysteinproteinasen bei Kultivierung mit Blut oder bei 42 C geringer geworden. Die Temperatur von 42 C simuliert die Lebertemperatur. Vermutlich müssen also noch andere Faktoren gesucht werden, die für eine Abszeßbildung in der Leber verantwortlich gemacht werden können.
Bei keiner der neuen Proteasen konnte eine Expression nachgewiesen oder induziert werden. Wann diese Proteasen von den Amöben genutzt werden, bleibt eine offene Frage. Zwei der neuen Proteasen konnten vervollständigt werden und es wurden Gen-Konstrukte zur Überexpression in den Amöben hergestellt. Somit wurden die Grundlagen für weitere Versuche gelegt.
Die Zugabe von lebendigen Crithidien zur Amöbenkultur ermöglicht den Amöben ein besseres Wachstum. Zugabe von Crithidien Extrakt hatte zwar eine leichte Steigerung des Wachstums zur Folge, jedoch konnte keine Extraktgabe an die Wachstumssteigerung durch die Zugabe von lebendigen Crithidien herankommen. Es wird nun vermutet, daß die Crithidien den Sauerstoff aus dem Kulturmedium für die Amöben entgiften. Mit diesen Versuchen wurde gezeigt, daß auch sehr geringe Mengen von Amöben dank Zugabe von Crithidien überleben können. Dies wird am BNI jetzt dadurch genutzt, daß zu transfizierten Amöben immer geringe Mengen von Crithidien gegeben werden, um die durch die Transfektion gestressten Amöben am Leben zu erhalten

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